做细胞实验，转染是绕不开的一道坎。

质粒买回来了，试剂配好了，操作步骤照着说明书来，可转染效率就是不理想——荧光信号弱、表达量低、甚至完全没有。这时候很多人第一反应是"试剂有问题"，但实际情况往往是：那两个最基础的参数设错了。

今天我们从贴壁细胞和悬浮细胞两种体系出发，梳理瞬时转染中关键参数的设置要点，以及效率低时的归因方向。

一、先搞清楚：转染前，细胞的状态是什么？

转染效率的"第一变量"是细胞状态，而状态好不好，最直观的指标就是汇合度和密度。

1.1 贴壁细胞的黄金汇合度：70%–90%

以Lipofectamine 2000/3000瞬时转染为例，细胞在转染时应处于对数生长期，汇合度建议为70%–90%。

这个范围不是随意定的。汇合度过低，细胞数量少，复合物接触面积小，转染效率自然上不去；汇合度过高，细胞间接触抑制明显，代谢减缓，同时试剂的细胞毒性更容易显现，反而影响转染效果。

实操提示：

• 转染前一天种板，根据细胞增殖速度调整种板密度，确保转染当天达到目标汇合度。
• 不建议在95%以上汇合时强行转染，除非先做毒性预实验评估细胞耐受度。
• 因转染效率依赖于细胞培养密度，且Lipo2000脂质体转染试剂具有细胞毒性，使用时需确保细胞密度处于合适范围。

1.2 悬浮细胞的密度范围：2×10⁶–4×10⁶/mL

悬浮体系（如293F细胞）的转染，密度控制更为关键。

以PEI法为例，转染前细胞应处于对数生长期，密度建议调整为2×10⁶–4×10⁶个/mL，且活细胞比需≥95%。

密度过低，单位体积内可转染的细胞数少，整体表达量上不去；密度过高，营养消耗快、代谢废物积累，转染后细胞状态迅速恶化，影响蛋白表达和后续检测。

实操提示：

• 转染当天计数时，务必用台盼蓝染色确认活率，活率低于95%的细胞群体不建议直接转染。
• 传代后适宜的细胞密度为50%-60%；转染前还需提前将密度调整至70%-90%，于37℃摇床培养2–4小时后再进行转染。

二、参数怎么设？两类体系的对照表

2.1 贴壁细胞瞬时转染（Lipofectamine 2000/3000体系）

关键注意点：

• 质粒质量：

  建议使用去内毒素试剂盒抽提，A260/A280比值应在1.7–1.9之间（越接近1.8越好）。

• 血清干扰：

  复合物制备必须使用无血清培养基（如Opti-MEM），血清中的成分会干扰脂质体与DNA的复合。

• L2000 vs L3000：

  L2000与L3000均为脂质体转染试剂，L3000适用于更多细胞类型（包括难转染细胞），两者均可在含血清培养基中直接使用，转染后无需更换培养基。

2.2 悬浮细胞瞬时转染（PEI法，以293F为例）

关键注意点：

• 质粒过滤：

  DNA溶液需经0.22 μm滤膜过滤除菌，避免细菌内毒素干扰。

• PEI保存：

  PEI试剂应避免反复冻融，建议-20℃分装保存，4℃条件下放置不超过一周使用。

• 混合均匀：

  DNA与PEI分别用300 mM NaCl稀释后混合，静置形成聚合物，滴加时要缓慢且摇床持续运转。

• 细胞要求：

  参与转染的细胞必须是培养三代或以上的稳定细胞株。

三、效率低怎么排查？先归因，再优化

转染效率不理想时，不要急着换试剂。先按以下清单逐项排查：

3.1 细胞状态类问题

3.2 试剂与操作类问题

3.3 需要预实验确认的参数

某些参数（如DNA用量、试剂比例、观察时间）因细胞类型和实验目的而异，建议在正式实验前：

1. 设置浓度梯度：

   以目标参数为中心，设置梯度范围进行预实验。

2. 评估细胞毒性：

   转染后观察细胞形态，必要时用台盼蓝或CCK-8检测活率。

3. 确定最佳时间点：

   根据目的基因的表达动力学，选择荧光或蛋白检测的最佳时间窗。

四、稳定转染的额外要点

若需建立稳定表达细胞株（如病毒包装），还需注意以下要点：

关键注意点：

• 病毒包装后需每隔一段时间收集上清，且病毒相关耗材需经专业处理。
• 若使用polybrene辅助转导，敏感细胞需在4小时内稀释polybrene。

五、结语

转染效率低，大多数时候不是试剂的锅，而是那两个最基础的参数——汇合度和密度——没有设对。

尤其是贴壁细胞的70%–90%汇合度，以及悬浮细胞的2×10⁶–4×10⁶/mL密度，这两个数字背后是对数生长期细胞的最佳转染窗口。错过这个窗口，后续所有操作都可能事倍功半。

当然，转染是一个多因素耦合的系统，除了这两个核心参数，质粒纯度、培养基成分、操作细节同样重要。遇到效率问题时，建议按本文第三部分的排查清单逐项核对，先定位问题，再优化方案。

 参考文献与资料来源

1. 基因转录调控研究_体外转染.pdf

内容涵盖Lipofectamine™2000瞬时转染（贴壁细胞）、悬浮细胞瞬时转染（PEI法）、稳定转染操作流程及关键参数

2. Lipofectamine-2000-protocol-zh.pdf

（Thermo Fisher，编号MAN0007824，版本1.0）

官方转染实验方案，明确说明：转染后无需去除转染复合物或更换/添加培养基

3. Lipofectamine3000_protocol_Chinese.pdf

（编号MAN0009872，版本B.0）

官方转染实验方案，适用于多种真核细胞（包括难转染细胞）

4.Promega.pdf

（FuGENE® HD转染试剂技术手册）

5. "Mycoplasma contamination impairs transfection efficiency", Lonza Bioscience

6. "10 Common Mistakes in Cell Culture (and How to Avoid Them)", Celltech Discovery Solutions

7. "How to Reduce Cell Culture Variability", Promega Connections

8. "General guidelines for successful transfection", Qiagen Knowledge Hub